成人区人妻精品一区二区不卡网站,欧美大荫蒂av高潮,久久中文字幕无码A片不卡古代,欧美熟妇另类久久久久久多毛

歡迎來北京索萊寶科技有限公司!我們將為您提供周到的服務(wù)!
產(chǎn)品分類Product categories
首頁 > 新聞中心 > 遺傳霉素是細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染常用的抗性篩選試劑
遺傳霉素是細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染常用的抗性篩選試劑
  遺傳霉素又稱新霉素(geneticin, G418),是一種氨基糖苷類抗生素,是細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染常用的抗性篩選試劑。
 
  產(chǎn)品篩選
 
  由于每種細(xì)胞對G418的敏感性不同,而且不同的廠家生產(chǎn)的相同濃度的G418的活性不盡相同,所以在篩選之前,一定要確定G418的佳篩選濃度。具體如下:將細(xì)胞稀釋到1000個細(xì)胞/mL,在100ug/mL~1mg/mL的G418濃度范圍內(nèi)進(jìn)行篩選,選擇出在10~14天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的低G418濃度來進(jìn)行下一步的篩選試驗(yàn)。
 
  由于每種細(xì)胞對G418的敏感性不同,一般變動在100ug/ml~1000ug/ml范圍。在篩選之前,一定要確定細(xì)胞對這一批G418的佳篩選濃度。盡管如此,特性明確的細(xì)胞系G418的佳用量還是穩(wěn)定的。《分子克隆》給出了幾個常用細(xì)胞系所需G418的佳用量。
 
  由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)。所以篩選不能太早;但是也不能太晚,因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大,增值較慢,時間長了就會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒,終導(dǎo)致篩選不出陽性克隆,一般要在轉(zhuǎn)染24小時之后才開始加G418篩選。隨著細(xì)胞的代謝G418的濃度和活性都會下降,所以每3~5天都要更換一次含有G418的篩選液。這時藥物濃度可以降200ug/ml。
 
  加藥篩選約6天左右,細(xì)胞會大量死亡,孔中只剩下的細(xì)胞。這時會出現(xiàn)兩個問題:1.死亡的細(xì)胞會裂解釋放出有害物質(zhì),導(dǎo)致那些有neo表達(dá)的陽性細(xì)胞死亡,即非選擇性死亡。2.孔中細(xì)胞數(shù)目很少,細(xì)胞之間的信號會變得很弱,也會導(dǎo)致陽性細(xì)胞的狀態(tài)不佳甚死亡。這個時候需要一種特殊的培養(yǎng)液:假如你要轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞,在3T3細(xì)胞匯合度達(dá)到80%的時候,換液,培養(yǎng)過夜之后收集培養(yǎng)液,通過濾器消毒,和新鮮的培養(yǎng)液按1:1混合備用。再轉(zhuǎn)染后篩選過程中就可以應(yīng)用這種培養(yǎng)基。
 
  為了盡量減少陰性克隆的死亡給陽性克隆造成的不利影響以及增加陽性克隆的得率,可以應(yīng)用套環(huán)法或刮除法結(jié)合有限稀釋法來篩選陽性克隆。加藥后,在高倍鏡下,陽性克隆和陰性克隆很容易辨認(rèn),在陽性克隆下用記號筆做個標(biāo)記。然后刮除陰性克隆,消化陽性克隆后繼續(xù)篩選培養(yǎng);或者用套環(huán)套住陽性克隆,在套環(huán)內(nèi)加胰蛋白酶或EDTA消化,把消化液吸到另外一個新的孔中培養(yǎng)。后再用有限稀釋法把陽性克隆在96孔板中篩選。
 
  一般經(jīng)過4周左右的篩選,得到的陽性克隆都比較穩(wěn)定。但是外源基因如果沒有整合到基因組中的話,目的基因還是很容易丟失的。但是外源基因整合到基因組中的概率太小了,而且是隨機(jī)整合,會導(dǎo)致表達(dá)的目的蛋白的量產(chǎn)生很大差異。隨著培養(yǎng)時間的延續(xù),那些丟失了外源基因的細(xì)胞和很少表達(dá)目的基因的細(xì)胞會占據(jù)優(yōu)勢,強(qiáng)表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞會越來越少。這樣再次篩選是*的。只有經(jīng)過2次以上的篩選之后才能找到那種我們想要的強(qiáng)分泌目的蛋白的,遺傳穩(wěn)定的細(xì)胞克隆。

版權(quán)所有  ICP備案號: 管理登陸 技術(shù)支持:化工儀器網(wǎng)   總流量:938859  網(wǎng)站地圖

av人摸人人人澡人人超碰导航| 亚洲av午夜福利精品一区| 狠狠综合久久AV一区二区| 成人午夜亚洲精品无码网站| 久久久不卡国产精品一区二区| 亚洲va中文字幕| AV高潮喷水一区二区三区| 国产精品久久久久久久9999| 久久精品无码一区二区日韩av| 亚洲成a人片77777kkkk| 久久人人爽人人爽人人AV东京热| 国产成人A∨激情视频厨房| 在线播放免费人成毛片乱码| 在线观看大片免费播放器 | 两个人免费视频| 欧美日本精品一区二区三区| 性欧美乱熟妇XXXX白浆| 伊人久久大香线蕉AV一区| 亚洲中文字幕无码av永久| 国产又黄又爽又湿的免费网站| 国产欧美成人一区二区A片| WWW色情成人免费视频软件 | 5566视频一区二区三区| 久久久久亚洲AV无码A片| 羞羞答答麻豆国产免费观看| 野花日本韩国视频免费8| 自拍 另类 综合 欧美小说| 欧美日韩国产成人高清视频| 国99精品无码一区二区三区| 亚洲另类精品无码专区| 国产精品亚洲精品久久精品| 二区国产好的精华液单品榜| 亚洲综合欧美色五月俺也去 | 欧美性大战久久久久久| 香蕉欧美成人精品A∨在线观看| 亚洲av午夜精品麻豆av| 国产婷婷一区二区三区| 精品国产乱码久久久人妻| 久久久久久久波多野结衣高潮| 漂亮人妻被修理工侵犯| 免费av欧美国产在钱|