細胞培養(yǎng)技術(shù)也叫細胞克隆技術(shù)，在生物學中的正規(guī)名詞為細胞培養(yǎng)技術(shù)。現(xiàn)代生物技術(shù)一般認為包括基因工程技術(shù)、細胞工程技術(shù)、酶工程技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)，而這些技術(shù)的發(fā)展幾乎都與細胞培養(yǎng)有密切關(guān)系，特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展，細胞培養(yǎng)更具有特殊的作用和價值。以下來具體講一下細胞培養(yǎng)的步驟。

    細胞培養(yǎng)的步驟

    一、細胞復蘇：

    1. 將新鮮培養(yǎng)基置于37℃水浴鍋中回溫，回溫后噴以75%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內(nèi)。如配置：50mL完-全培養(yǎng)基(含10%FBS，1%青鏈霉素雙抗)44.5mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基 + 5mL FBS + 0.5mL青鏈霉素雙抗。

    2. 戴防護手套后，自液氮罐中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，立即放入37℃水槽中快速解凍（避免冰晶重新結(jié)晶而造成細胞死亡），輕搖冷凍管使其在2分鐘內(nèi)全部融化，以75%酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。

    3. 將解凍的1mL細胞懸液緩緩加入細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，再向瓶中加入10mL完-全培養(yǎng)基(稀釋比例為1:10)，混合均勻，放入37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取0.1ml解凍細胞懸液作存活測試。(Sf9細胞在27℃生長，可不需CO2)

    4. 一般而言，細胞大都不需立即去除冷凍保護劑(例如DMSO)。若要立即去除，則將解凍的細胞懸液加入含有5-10ml培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1300rpm，5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。

    二、傳代培養(yǎng)：

    1. 37℃恒溫培養(yǎng)約48小時，待細胞長滿80-90%后，從培養(yǎng)箱取出75cm2培養(yǎng)瓶，倒掉培養(yǎng)基。加入5mLPBS緩沖液吹打以洗去殘留血清，倒掉緩沖液。

    2. 沿壁（無細胞的一面）緩緩加入1mL胰酶溶液消化細胞約1min，輕輕搖晃，倒掉殘余胰酶，將培養(yǎng)瓶置于恒溫箱中約1min，拿出培養(yǎng)瓶輕輕拍打一下細胞貼壁的一面。

    注意：最佳消化溫度是37℃，加液后用移液管反復吹打分散細胞。

    3. 向瓶中加入5mL完-全培養(yǎng)基，反復吹打均勻2min，從中取出20μl至0.5ml小離心管中，向管中加入80μl臺盼藍溶液，混勻，從混合液中取出10μl至蓋好蓋玻片的計數(shù)板上，計算細胞密度及活率。

    4. 將5mL細胞懸液全部吸出，分別接種1mL懸液到原培養(yǎng)瓶和另一新的培養(yǎng)瓶中，其余舍棄。再向兩瓶中各加入10mL完-全培養(yǎng)基，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（細胞傳代時按1：5或更大比例稀釋）

    三、細胞計數(shù)與存活測試：

    1. 取10μl混合液自血球計數(shù)盤chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞則為藍色。

    2. 計數(shù)四個大方格的細胞總數(shù)。計數(shù)板計數(shù)時，最適濃度為5～10×105細胞/ml。高濃度細胞懸液，可取出部分稀釋后計數(shù)。

    3. 每一大格的體積為0.1cm×0.1cm×0.01cm= 10-4ml。若細胞位于線上，只計左線與上線的細胞。

    注：細胞密度= 四大格細胞總數(shù)×稀釋倍數(shù)×104/4= 細胞數(shù)/ml；

    細胞活率= 活細胞數(shù)/（活細胞數(shù)+死細胞數(shù)）×100%。                         

    四、細胞凍存：

    1. 冷凍前確保細胞處于指數(shù)生長期，傳代后的5mL細胞懸液取出1mL接種到培養(yǎng)瓶繼續(xù)傳代。另取一無菌離心管，將剩余4mL細胞懸液置于其中，離心1000rpm，5min（轉(zhuǎn)速勿超過1500rpm）。

    2. 離心后倒掉上層清液，收集下層細胞沉淀。向離心管中加入900ul完-全培養(yǎng)基，用槍頭反復吹打重懸起細胞。取少量細胞懸液計數(shù)細胞濃度及凍前存活率。一般細胞濃度為2~5×106cells/ml較適宜。

    3. 將細胞懸液轉(zhuǎn)入1.5mL無菌凍存管中，再加入100ul試劑級DMSO，混勻，制成細胞凍存懸液（DMSO最后濃度為10％）。嚴密封口后，注明細胞名稱、代數(shù)、日期，然后進行凍存。

    注意：對Sf9細胞而言，凍存比例為：95%培養(yǎng)液+5%DMSO。

    5. 傳統(tǒng)方法：冷存管置于4℃10分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16~18小時（隔夜）→液氮罐長期儲存。（-20℃勿超過1小時，防止胞內(nèi)冰晶過大造成細胞死亡）